云南大学实验动物中心基因编辑技术服务流程

联系人：云南大学实验动物中心，李卓霏老师

联系方式：18987269375（微信同号）；lzfbone@163.com

地址：动物中心106办公室，0871-65955427

流程说明：

建议提供的样品浓度：

Cas9 KO:  Cas9/gRNA 浓度建议100/50ng/μL

Cas9 KI:   Cas9/gRNA /Donor浓度建议100/50/100-200ng/μL

注： 如果Donor基因采用质粒形式最好线性化，另外ssDNA或dsDNA效果会比质粒好一些。
        酶切位点选择：
        类别一：EcoRl/HindIII/BamHI/Xhol/EcoRV/XbaI/Kpnl；
        类别二：Scal/BsaI/PvuI/Notl/BspQI （一般用于mRNA质粒线性化）；
        注意不要在外源基因序列中或关键元件处切开，一般选在原核扩增时所需要基因或元件处断开。

转基因:  DNA双酶切产物纯化后浓度建议30-50ng/μL

注： mRNA和Donor、线性化质粒在交付前均需要做验证，并提供验证结果（胶图或测序）。

注射流程：

• 1、建议提交注射的RNA量≥30μL，每一枚卵的注射量5-8pL。如有多条sgRNA请分别装管，纯化后请用TE或者DEPC水洗脱。
• 2、编辑方案所需时间：所有方案启动后，sgRNA制备及验证约2-4周，涉及Donor质粒构建的，根据序列复杂程度不同一般1-2月完成，进入显微注射流程后4-6周可拿到F0代小鼠，可根据客户需要提供F0代鉴定。
• 3、注射方式：平台默认采用受精卵胞浆和原核结合注射的注射方式。
• 4、注射胚胎数：Cas9 KO、转基因：平台一共负责注射300枚，直至获得F0后代阳性小鼠（≥1只）；
                             Cas9 KI：平台一共负责注射600枚，直至获得F0后代阳性小鼠（≥1只）。
• 5、平台默认使用胚胎供体品系：小鼠C57BL/6J，默认假孕受体品系：小鼠ICR。如有注射小鼠的特殊需求须提前沟通。
• 6、方案启动后，平台定期进行实验进度反馈。

收费标准：

•  由于基因编辑动物模型构建存在一定的技术风险，实验成功（获得≥1只阳性F0）则收取项目总金额全部费用，实验失败（没有获得阳性F0），则收取项目总金额的15%做为基础实验技术服务费用，包括小鼠超排&IVF费用、试剂购置费、人工成本费等。如果是课题组提供的RNA质量不符要求，这类情况照总金额收费。

风险须知：

• 1、KI、TG等方案的插入概率低，同时受插入片段大小和插入基因位置影响，存在无法获得阳性F0代的风险；
• 2、若因编辑基因自身问题发生不育、胚胎死亡或早期死亡等，或因方案中提示的上述风险问题导致无法得到阳性F0代，中心会提供相关数据，课题组须承担已经产生的费用。